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    • 专利摘要:
    本發明提供一種具有高蛋白質分解活性，且肽生成能力及/或胺基酸生成能力優異之乳酸菌。本發明提供一種高濃度地含有胺基酸及/或肽，且風味良好之醱酵乳。具體而言，本發明提供一種屬於瑞士乳酸菌之乳酸菌，其特徵在於具有以下(a)~(d)中之至少1種性質：(a)藉由使獸乳醱酵而生成25 μmol/ml以上之游離胺基酸；(b)藉由使獸乳醱酵而生成8.5 mg/ml以上之肽；(c)藉由使獸乳醱酵而生成總量為260 μg/ml以上之XP肽及/或XPP肽；(d)使獸乳於30℃以上34℃以下醱酵所獲得之醱酵乳之單位酸度之IPP肽及VPP肽的量以VPP換算量計為6.0 mg/g以上。
    公开号:TW201305331A
    申请号:TW100140985
    申请日:2011-11-09
    公开日:2013-02-01
    发明作者:Taketo Wakai；Misaki Hatanaka；Yasunori Nakamura；Naoyuki Yamamoto
    申请人:Calpis Co Ltd；
    IPC主号:A23C9-00
    专利说明:
    具有高蛋白質分解活性之瑞士乳酸菌
    本發明係關於一種新穎之屬於瑞士乳酸菌之乳酸菌。又，本發明係關於一種使該乳酸菌醱酵所獲得之醱酵乳、以及含有該乳酸菌之組合物及飲食品。進而本發明係關於一種使用該乳酸菌之胺基酸及/或肽之製造方法。
    已知乳蛋白或食物蛋白中潛在有功能性肽，而正在進行藉由利用酵素分解或醱酵對乳蛋白或食物蛋白進行加工而加以利用之嘗試。例如，作為此種功能性肽，報告有三肽VPP(Valine-Proline-Proline，纈胺酸-脯胺酸-脯胺酸)及IPP(Isoleucine-Proline-Proline，異白胺酸-脯胺酸-脯胺酸)具有血管緊張素轉化酵素(ACE，Angiotensin Converting Enzyme)抑制作用，並顯示降血壓作用(專利文獻1~4及非專利文獻1)。
    作為VPP及IPP以外之源自乳之功能性肽，報告有作為二肽之YP具有降血壓作用及抗焦慮效果(專利文獻5)。又，報告有作為二肽之IP、AP、EP、RP、QP、TP、MP及GP係難分解性，且具有ACE抑制活性之肽群(例如專利文獻6)。
    另一方面，已知瑞士乳酸菌(L. helveticus)自先前起即用於乳製品之製造中，蛋白質分解活性較高。為了提供更容易攝取、易於加工之醱酵乳，報告有幾種蛋白質分解活性較高、肽產生性優異之L. helveticus株(專利文獻1~4及7、非專利文獻1)。
    因蛋白質係由胺基酸所構成，故可藉由進一步分解而亦成為胺基酸之供給源。已知胺基酸於營養、風味以外亦具有各種功能。例如，已知支鏈胺基酸(BCAA，Branched Chain Amino Acid)包含於構成肌肉之蛋白質中，於運動時等肌肉中之BCAA被消耗而作為能量使用，因此BCAA之補充較為重要。又，丙胺酸(Ala)係作為肝臟之能量源而為人所知之糖原性胺基酸。由於消耗分解酒精時所產生之NADH(reduced nicotinamide adenine dinucleotide，還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸)，故認為由於Ala之存在而進行肝臟中之分解反應。又，亦已知Ala於味覺方面引出美味，具有鹽醃、醋醃效果或刺激味等掩蓋效果。一般認為，離胺酸(Lys)係必需胺基酸之中最容易不足之胺基酸。必需以抗體或激素、酵素等原材料之形式攝取。又，報告有Lys亦與鈣吸收、膠原蛋白形成、骨組織之生產有關。絲胺酸(Ser)作為磷脂絲胺酸或其他胺基酸等生物體內之各種重要物質之前驅物較為重要。又，已知其降低血膽固醇，藉由使腦內之神經元活化等抑制腦細胞死亡而防止腦之老化，或成為皮膚之保濕成分。
    為生成此種胺基酸而積極地進行微生物之利用。然而，關於可作為微生物之醱酵物本身而攝取之胺基酸並無較多之例。乳酸菌中，為影響醃菜之風味而篩選向胺基酸之分解優異之乳酸菌，但並不知道為了以醱酵乳本身攝取功能性胺基酸及功能性肽而進行研究之例。 [先前技術文獻] [專利文獻]
    [專利文獻1]歐州專利第1016709B號
    [專利文獻2]國際公開WO 01/32836號
    [專利文獻3]國際公開WO 2007/096510號
    [專利文獻4]歐州專利第1820850號
    [專利文獻5]歐州專利第0821968號
    [專利文獻6]歐州專利第1661909號
    [專利文獻7]日本專利特開平7-274949號公報 [非專利文獻]
    [非專利文獻1]Nakamura,Y. et al.,J. Dairy Sci.第78卷第1253-1257頁，1995年
    因此，本發明之目的在於提供一種具有高蛋白質分解活性，且肽生成能力及/或胺基酸生成能力優異之乳酸菌。又，本發明之目的在於提供一種高濃度地含有胺基酸及/或肽，且風味良好之醱酵乳。
    本發明者等人為解決上述課題而進行了努力研究，結果成功地自屬於瑞士乳酸菌之乳酸菌株中取得自乳蛋白生成胺基酸之能力及生成功能性肽之能力優異，且與先前之乳酸菌相比具有較高之蛋白質分解活性的菌株。又，獲得可使用該菌株獲得胺基酸及/或肽之含量較多之醱酵乳及組合物而製造胺基酸及/或肽之見解，以致完成本發明。
    即，本發明係包含如下內容。
    [1]　一種屬於瑞士乳酸菌之乳酸菌，其特徵在於具有以下(a)~(d)中之至少1種性質：
    (a)　藉由使獸乳醱酵而生成25 μmol/ml以上之游離胺基酸；
    (b)　藉由使獸乳醱酵而生成8.5 mg/ml以上之肽；
    (c)　藉由使獸乳醱酵而生成總量為260 μg/ml以上之XP肽及/或XPP肽；
    (d)　使獸乳於30℃以上34℃以下醱酵所獲得之醱酵乳之單位酸度之IPP肽及VPP肽的量以VPP換算量計為6.0 mg/g以上。
    [2]　如[1]之乳酸菌，其中游離胺基酸之15%以上為支鏈胺基酸。
    [3]　如[1]或[2]之乳酸菌，其中游離胺基酸含有選自丙胺酸、離胺酸及絲胺酸之至少1種。
    [4]　如[1]至[3]中任一項之乳酸菌，其中生成60 μg/ml以上之YP肽。
    [5]　如[1]至[4]中任一項之乳酸菌，其為瑞士乳酸菌CM4株(台灣寄存編號CCRC 910111、日本寄存編號FERM BP-6060)之變異株。
    [6]　如[1]至[5]中任一項之乳酸菌，其為瑞士乳酸菌CP3232株(台灣寄存編號BCRC 910539、日本寄存編號FERM BP-11271)或其變異株。
    [7]　一種乳酸菌，其為瑞士乳酸菌CP3232株(台灣寄存編號BCRC 910539、日本寄存編號FERM BP-11271)。
    [8]　一種用於自獸乳生成胺基酸及/或肽之組合物，其特徵在於含有至少1種屬於瑞士乳酸菌之乳酸菌。
    [9]　如[8]之組合物，其藉由使獸乳醱酵而生成25 μmol/ml以上之游離胺基酸。
    [10]　如[9]之組合物，其中游離胺基酸之15%以上為支鏈胺基酸。
    [11]　如[9]或[10]之組合物，其中游離胺基酸含有選自丙胺酸、離胺酸及絲胺酸之至少1種。
    [12]　如[8]至[11]中任一項之組合物，其中藉由使獸乳醱酵而生成8.5 mg/ml以上之肽。
    [13]　如[8]至[12]中任一項之組合物，其中藉由使獸乳醱酵而生成總量260 μg/ml以上之XP肽及/或XPP肽。
    [14]　如[8]至[13]中任一項之組合物，其中藉由使獸乳醱酵而生成60 μg/ml以上之YP肽。
    [15]　如[8]至[14]中任一項之組合物，其中使獸乳於30℃以上34℃以下醱酵所獲得之醱酵乳之單位酸度之IPP肽及VPP肽的量為6.0 mg/g以上。
    [16]　如[8]至[15]中任一項之組合物，其中乳酸菌為如[1]至[7]中任一項者。
    [17]　一種醱酵乳，其特徵在於：藉由使用至少1種屬於瑞士乳酸菌之乳酸菌使獸乳醱酵而獲得，且含有以下(a)~(d)中之至少1中成分：
    (a)　25 μmol/ml以上之游離胺基酸；
    (b)　8.5 mg/ml以上之肽；
    (c)　總量為260 μg/ml以上之XP肽及/或XPP肽；
    (d)　6.0 mg/g以上之IPP肽及VPP肽之單位酸度之VPP換算量。
    [18]　如[17]之醱酵乳，其為含有至少1種屬於瑞士乳酸菌之乳酸菌者。
    [19]　如[17]或[18]之醱酵乳，其為含有如[1]至[7]中任一項之至少1種乳酸菌者。
    [20]　如[17]至[19]中任一項之醱酵乳，其中游離胺基酸之15%以上為支鏈胺基酸。
    [21]　如[17]至[20]中任一項之醱酵乳，其中游離胺基酸含有選自丙胺酸、離胺酸及絲胺酸之至少1種。
    [22]　如[17]至[21]中任一項之醱酵乳，其含有60 μg/ml以上之YP肽。
    [23]　如[17]至[22]中任一項之醱酵乳，其中醱酵係於30℃以上34℃以下之溫度下進行。
    [24]　如[17]至[23]中任一項之醱酵乳，其係用作降血壓劑、腦功能改善劑、自主神經調節劑、副交感神經調節劑、交感神經調節劑、營養佐劑、能量補充劑、肌肉分解損傷抑制劑、肌肉增強劑、疲勞緩解劑、耐力改善劑、調味劑或酒精代謝劑者。
    [25]　一種飲食品，其特徵在於：含有如[1]至[7]中任一項之至少1種乳酸菌及/或其處理物、以及/或者如[17]至[24]中任一項之醱酵乳及/或其處理物。
    [26]　一種胺基酸及/或肽之製造方法，其特徵在於：使用如[1]至[7]中任一項之至少1種乳酸菌或如[8]至[16]中任一項之組合物使獸乳或乳蛋白醱酵，並自所獲得之醱酵物提取胺基酸及/或肽。
    [27]　如[26]之方法，其中胺基酸為支鏈胺基酸。
    [28]　如[26]或[27]之方法，其中胺基酸含有選自丙胺酸、離胺酸及絲胺酸之至少1種。
    [29]　如[26]至[28]中任一項之方法，其中肽為選自由XP肽及XPP肽所組成之群中之至少1種。
    [30]　如[26]至[29]中任一項之方法，其中於30℃以上34℃以下之溫度下進行醱酵。
    [31]　一種方法，其係取得具有蛋白質分解活性之屬於瑞士乳酸菌之乳酸菌的方法，且其包括以下步驟：
    (a)　製備瑞士乳酸菌CM4株(台灣寄存編號CCRC 910111、日本寄存編號FERM BP-6060)或瑞士乳酸菌CP3232株(台灣寄存編號BCRC 910539、日本寄存編號FERM BP-11271)之變異株之步驟；及
    (b)　自該變異株選拔具有以下(a)~(d)中至少1種性質之菌株之步驟：
    (a)　藉由使獸乳醱酵而生成25 μmol/ml以上之游離胺基酸，
    (b)　藉由使獸乳醱酵而生成8.5 mg/ml以上之肽，
    (c)　藉由使獸乳醱酵而生成總量為260 μg/ml以上之XP肽及/或XPP肽，
    (d)　使獸乳於30℃以上34℃以下醱酵所獲得之醱酵乳之單位酸度之IPP肽及VPP肽的量以VPP換算量計為6.0 mg/g以上。
    [32]　一種功能性飲食品之製造方法，其包括如下步驟：製備如[1]至[7]中任一項之至少1種乳酸菌及/或其處理物、以及/或者如[17]至[24]中任一項之醱酵乳及/或其處理物之步驟；及將該乳酸菌及/或其處理物以及/或者醱酵乳及/或其處理物調配至飲食品中之步驟。
    根據本發明，提供一種具有高蛋白質分解活性，且肽生成能力及/或胺基酸生成能力優異之屬於瑞士乳酸菌之乳酸菌。本乳酸菌所生成之胺基酸及/或肽係具有各種功能者，例如IPP、VPP、YP等肽具有降血壓作用。又，藉由將本乳酸菌用於醱酵中，看獲得高濃度地含有此種具有各種功能之多種胺基酸及/或肽之醱酵乳。由於所獲得之醱酵乳之單位酸度之IPP及VPP肽的量較高，故而並不存在先前之由伴隨醱酵之進行而生成之乳酸所引起的酸度較高之問題。即，由於可製造相對於生成乳酸量含有大量胺基酸及/或肽之醱酵乳，故而可使用少量之醱酵乳，簡便地製造在維持功能性之情況下風味良好且容易飲用之形態的製品，並提供給消費者。
    以下詳細地說明本發明。本申請案係主張2010年11月9日提出申請之日本專利申請案第2010-250754號之優先權者，包含上述專利申請案之說明書及/或圖式中記載之內容。
    本發明之屬於瑞士乳酸菌(Lactobacillus helveticus)之乳酸菌係藉由醱酵而自糖類產生乳酸之乳酸菌之1種，本說明書中亦稱為「本發明之乳酸菌」。本發明之乳酸菌之特徵在於具有高蛋白質分解活性，且胺基酸生成能力及/或功能性肽生成能力優異。具體而言，其係具有下述(a)~(d)之性質中之至少1種者：
    (a)　藉由使獸乳醱酵而生成25 μmol/ml以上、較佳為30 μmol/ml以上之游離胺基酸；
    (b)　藉由使獸乳醱酵而生成8.5 mg/ml以上、較佳為10 mg/ml以上之肽；
    (c)　藉由使獸乳醱酵而生成總量為260 μg/ml以上、較佳為280 μg/ml以上、進而較佳為300 μg/ml以上之XP肽及/或XPP肽；
    (d)　使獸乳於30℃以上34℃以下醱酵所獲得之醱酵乳之單位酸度之IPP肽及VPP肽的量以VPP換算量計為6.0 mg/g以上。
    上述(a)~(d)之性質可藉由該技術領域中公知之方法，以例如下述實施例中記載般進行判定。若簡單地進行說明，則可首先以乳蛋白(例如獸乳)作為基質而使屬於瑞士乳酸菌之乳酸菌於30~45℃、較佳為30~34℃下醱酵10~30小時，再藉由測定所獲得之乳蛋白醱酵物中所含之游離胺基酸或肽之量、酸度等而判定上述(a)~(d)之性質。
    關於(a)，胺基酸之量可使用公知之胺基酸分析裝置，例如高效液相層析儀進行測定。本發明之乳酸菌係藉由獸乳之醱酵而生成25 μmol/ml以上、較佳為30 μmol/ml以上之游離胺基酸者。又，較佳為，生成5 μmol/ml以上、更佳為6 μmol/ml或7 μmol/ml以上之支鏈胺基酸，且所生成之游離胺基酸中15%以上、更佳為19%或20%以上為支鏈胺基酸(纈胺酸、白胺酸、異白胺酸)。又，游離胺基酸較佳為含有選自丙胺酸、離胺酸及絲胺酸之至少1種2000 μg/ml以上，進而較佳為含有至少2種以上胺基酸各1500 μg/ml。
    關於(b)，肽之量可使用該技術領域中公知之方法，例如OPA(O-Phthaldialdehyde，鄰苯二甲醛)法(Church等人，J. Dairy Sci. 1983. 66:1219-1227)測定。本發明之乳酸菌係藉由獸乳之醱酵而生成8.5 mg/ml以上、較佳為10 mg/ml以上之肽者。
    關於(c)，XP肽係指包含Xaa-Pro(Xaa為任意胺基酸)之肽，XP肽中包含例如：YP(Tyr-Pro，酪胺酸-脯胺酸)、VP(Val-Pro，纈胺酸-脯胺酸)、IP(Ile-Pro，異白胺酸-脯胺酸)、AP(Ala-Pro，丙胺酸-脯胺酸)、EP(Glu-Pro，穀胺酸-脯胺酸)、RP(Arg-Pro，精胺酸-脯胺酸)、QP(Gln-Pro，穀胺醯胺-脯胺酸)、TP(Thr-Pro，蘇胺酸-脯胺酸)、MP(Met-Pro，甲硫胺酸-脯胺酸)及GP(Gly-Pro，甘胺酸-脯胺酸)。又，XPP肽係指包含Xaa-Pro-Pro(Xaa為任意胺基酸)之肽，XPP肽中包含例如：VPP(Val-Pro-Pro，纈胺酸-脯胺酸-脯胺酸)、IPP(Ile-Pro-Pro，異白胺酸-脯胺酸-脯胺酸)及LPP(Leu-Pro-Pro，白胺酸-脯胺酸-脯胺酸)。再者，本說明書中亦將該等XP肽及XPP肽分別稱為二肽及三肽，又，亦總稱為「功能性肽」。XP肽及/或XPP肽之量可使用公知之LC/MS(Liquid chromatography/Mass spectrometry，液相色譜質譜聯用)裝置進行測定。本發明之乳酸菌藉由獸乳之醱酵而生成總量為260 μg/ml以上、較佳為280 μg/ml以上、更佳為300 μg/ml以上之XP肽及/或 XPP肽。尤佳為生成60 μg/ml以上、更佳為65 μg/ml以上、進而較佳為70 μg/ml以上之YP肽。
    關於(d)，酸度(醱酵乳中之酸濃度)可藉由公知之中和滴定法，使用例如公知之自動滴定裝置進行測定。又，IPP肽及VPP肽可藉由針對(c)所記載之方法進行測定。本發明之乳酸菌係使獸乳於30℃以上34℃以下醱酵所獲得之醱酵乳之單位酸度之IPP肽及VPP肽的量以VPP換算量計為5.5 mg/ml以上、較佳為6.0 mg/ml以上者。再者，上述量係將醱酵乳比重設為1.02而算出。又，本說明書中記載之IPP肽及VPP肽之量係以ACE抑制活性為基礎之VPP換算量，可藉由下述式求出：
    (VPP換算量μg/ml)=IPP量(μg/ml)×1.7+VPP量(μg/ml)
    本發明之乳酸菌係具有上述(a)~(d)中至少1種性質者，但較佳為顯示上述性質中之2種、3種或全部之乳酸菌。例如，本發明之乳酸菌為如下者：具有(a)、(b)、(c)或(d)之性質，或者具有(a)及(b)、(a)及(c)、(a)及(d)、(b)及(c)、(b)及(d)、或(c)及(d)之性質，或者具有(a)及(b)及(c)、(a)及(b)及(d)、(a)及(c)及(d)、(b)及(c)及(d)之性質，或者具有(a)~(d)之性質。
    於本發明中，只要為顯示上述性質中之至少1種之屬於瑞士乳酸菌的乳酸菌，則包含於本發明之乳酸菌中。作為具有此種性質之較佳之瑞士乳酸菌，可列舉本發明者自以瑞士乳酸菌CM4株(台灣寄存編號CCRC 910111、日本寄存編號FERM BP-6060，專利文獻1)為母株所獲得之變異株中單獨選拔之瑞士乳酸菌CP3232株。再者，瑞士乳酸菌CM4株及CP3232株係由本申請人於作為基於用於專利微生物寄存之布達佩斯條約(Budapest Treaty)的國際寄存當局之獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心(日本茨城縣築波市東1丁目1番地1中央第6郵政編碼305-8566)，分別於平成9年(1997年)8月15日及平成22年(2010年)8月4日寄存為FERM BP-6060及FERM BP-11271。已確認瑞士乳酸菌CP3232株如實施例中記載般具有所有上述(a)~(d)之性質。其中，瑞士乳酸菌CM4株已於1998年9月16日寄存於食品工業發展研究所，寄存編號為CCRC 910111；瑞士乳酸菌CP3232株已於2012年1月12日寄存於食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910539。
    又，瑞士乳酸菌CP3232株如上所述係源自作為母株之瑞士乳酸菌CM4株之變異株。因此，瑞士乳酸菌CM4株及瑞士乳酸菌CP3232株之變異株亦具有上述(a)~(d)中任一性質之可能性較高。源自此種瑞士乳酸菌CP3232株或瑞士乳酸菌CM4株之變異株只要具有上述性質，則亦包含於本發明中。
    於本發明中，「變異株」係指自母株所獲得之任意株。具體而言，係指藉由自母株自然突然變異或利用由化學或物理變異原導致之誘導變異而人工提高突然變異之頻率之方法、或藉由特異性突然變異誘導技術(例如基因重組)所獲得之株。對藉由此種方法所生成之微生物個體重複進行選擇、分離，將有用之微生物個體進行育種，藉此可獲得具有目標性質之變異株。
    此處所謂之變異株，包括CM4株、CP3232株或以該變異株為母株所獲得之株。即，對CM4株進行數次變異處理並選擇之變異株亦包含於CM4株之變異株中。
    例如，源自瑞士乳酸菌CM4株之變異株、瑞士乳酸菌CP3232株及其變異株可根據藉由聚合酶鏈反應(PCR，polymerase chain reaction)法所得之乳酸菌之基因組DNA之放大片段的分子量分佈而容易地與其他乳酸菌株相區別。若簡單地進行說明，則係針對目標乳酸菌製備DNA試劑，藉由使用具有例如序列編號1及2中所示之序列之引子的PCR法進行基因放大，並分析所獲得之片段之電泳圖案，藉此可判斷是否為源自瑞士乳酸菌CP3232株或瑞士乳酸菌CM4株之變異株。但確認是否為變異株之方法並不限定於該方法，亦存在即便於未檢測出上述PCR片段之情形時，亦為源自瑞士乳酸菌CM4株之變異株、瑞士乳酸菌CP3232株之變異株之情況，可藉由針對其他基因片段之檢測或菌學性質等該技術領域中公知之方法而確認是否為變異株。
    可藉由判斷此種變異株是否具有上述(a)~(d)之性質而取得可用作本發明之乳酸菌之菌株。
    本發明之乳酸菌可藉由使用乳酸菌之培養中通常使用之培養基，於適當條件下進行培養而製備。培養中使用之培養基只要為含有碳源、氮源、無機鹽類等，並可有效地進行乳酸菌之培養者，則可使用天然培養基、合成培養基之任一者，只要為業者，即可為所使用之菌株適當選擇適合之公知之培養基。作為碳源，可使用乳糖、葡萄糖、半乳糖、赤糖蜜等，作為氮源，可使用酪蛋白之水解物、乳清蛋白水解物、大豆蛋白水解物等有機含氮物。又，作為無機鹽類，可使用磷酸鹽、鈉、鉀、鎂等。作為適於乳酸菌之培養之培養基，可列舉例如：MRS液體培養基、GAM培養基、BL培養基、日本鰻肝臟培養基(Briggs Liver Broth)、獸乳、脫脂乳、乳性乳清等。較佳為使用含有滅菌脫脂乳粉之乳培養基。
    又，本發明之乳酸菌之培養係於20℃至50℃、較佳為25℃至42℃、更佳為28℃至37℃下於厭氧條件下進行。溫度條件可藉由恆溫槽、覆套式加熱器、夾套等進行調整。又，厭氧條件下係指乳酸菌可增殖之程度之缺氧環境下，例如，可藉由使用厭氧腔室、厭氧箱或裝有脫氧劑之密閉容器或者袋子等，或者僅藉由密閉培養容器而製造厭氧條件。培養之形式為靜置培養、振盪培養、槽培養等。又，培養時間可設置為3小時至96小時。培養開始時之培養基之pH值較佳為維持於4.0~8.0。
    對本發明之乳酸菌之具體製備例簡單地進行說明。例如，於使用瑞士乳酸菌CP3232株之情形時，於滅菌乳培養基(含有9.00%(w/w)還原脫脂乳粉之乳培養基等)中以約5%之比例將乳酸菌進行植菌，並於28~37℃下經過一晚(約18~28小時)進行培養。較佳為重複進行該培養操作。
    培養後，可直接使用所獲得之培養物，亦可進而視需要進行利用離心分離等之部分純化及/或利用過濾等之固液分離或滅菌操作。
    又，只要具有目標性質，則可使用對本發明之乳酸菌進行處理所獲得之乳酸菌之處理物，又，亦可對乳酸菌之處理物進行進一步處理。將此種處理之例記載於下文中。
    可藉由使用乳酸菌之菌體及/或處理物使生乳、脫脂乳或豆乳醱酵而製備醱酵物。例如，將乳酸菌或經其他處理之乳酸菌接種於生乳、脫脂乳或豆乳等中，並於該技術領域中公知之乳酸菌醱酵條件(與上述乳酸菌培養之條件大致相同)下進行醱酵。所獲得之醱酵物可直接使用，或亦可進行過濾、滅菌、稀釋、濃縮等其他處理。
    可藉由使乳酸菌之菌體及/或處理物懸浮或稀釋於適當之溶劑中而製備成懸濁物或稀釋物。作為可使用之溶劑，例如可列舉：水、生理鹽水、磷酸緩衝生理鹽水(PBS，Phosphate buffered saline)等。
    可藉由對乳酸菌之菌體及/或處理物進行滅菌處理而製備成滅菌處理物。對乳酸菌之菌體及/或處理物進行滅菌處理時，例如，可進行過濾滅菌、放射性殺菌、過熱式殺菌、加壓式殺菌等公知之滅菌處理。
    又，可藉由對乳酸菌之菌體及/或處理物進行加熱處理而製備成加熱處理物。製備加熱處理物時，使乳酸菌之菌體及/或處理物歷經固定時間，例如約10分鐘~1小時(例如約10~20分鐘)，進行高溫處理(例如80~150℃)。
    可藉由將乳酸菌之菌體及/或處理物破碎、粉碎或磨碎而製備破碎物、無細胞萃取物。例如，此種破碎可藉由物理破碎(攪拌、過濾器過濾等)、酵素溶解處理、化學品處理或者自溶處理等而進行。
    可藉由使用適當之水性溶劑或有機溶劑對乳酸菌之菌體及/或處理物進行萃取而獲得萃取物。作為萃取方法，只要為使用水性溶劑或有機溶劑作為萃取溶劑之萃取方法則並無特別限制，可列舉將上述乳酸菌或對乳酸菌進行有其他處理之處理物於水性或有機溶劑(例如水、甲醇、乙醇等)中浸漬、攪拌或回流之方法等公知之方法。
    又，可將乳酸菌之菌體及/或處理物乾燥而製成粉狀物(粉末)或粒狀物。作為具體之乾燥方法，並無特別限制，例如可列舉：噴霧乾燥、轉筒乾燥、真空乾燥、冷凍乾燥等，可將該等單獨或組合使用。此時，亦可視需要而添加通常使用之賦形劑。
    再者，本發明之乳酸菌可為濕潤菌體或亦可為乾燥菌體。
    上述處理可進行單一處理，或者亦可將複數個處理適當組合進行。於本發明中，亦可與乳酸菌同樣地使用此種處理物。
    上文中所獲得之乳酸菌及/或處理物可單獨地或與其他成分一同用作用以自獸乳生成胺基酸及/或肽之組合物。即，本發明提供一種含有至少1種屬於瑞士乳酸菌之乳酸菌，且用以生成胺基酸及/或肽之組合物。
    本發明之組合物係可藉由使獸乳醱酵而生成25 μmol/ml以上、較佳為30 μmol/ml以上之游離胺基酸者。較佳為所生成之游離胺基酸之15%以上為支鏈胺基酸。或者進而，本發明之組合物係可藉由使獸乳醱酵而生成8.5 mg/ml以上、較佳為10 mg/ml以上之肽者。或者進而，本發明之組合物係可藉由使獸乳醱酵而生成總量為260 μg/ml以上、較佳為280 μg/ml、更佳為300 μg/ml以上之XP肽及/或XPP肽者。或者進而，本發明之組合物係使獸乳於30℃以上34℃以下醱酵所獲得之醱酵乳之單位酸度之IPP肽及VPP肽的量以VPP換算量計為6.o mg/g以上者。
    本發明之組合物係含有上述乳酸菌及/或處理物作為有效成分者，可含有1種乳酸菌及/或處理物，亦可含有複數種不同之乳酸菌及/或處理物，進而亦可組合含有經不同處理之複數種乳酸菌處理物。再者，本發明之組合物中較佳為含有1×107個/ml以上之乳酸菌之菌體。
    又，本發明之組合物中除有效成分乳酸菌以外，只要不妨礙目標作用，則亦可單獨地或組合複數種而添加該技術領域中公知之添加劑及賦形劑。又，本發明之組合物亦可含有促進乳酸菌之醱酵之添加物(例如麩胺酸或葡萄糖等糖)。本發明之組合物之形態並無特別限制，可製成懸濁液、顆粒、粉末、膠囊等。本發明之組合物中之有效成分(乳酸菌)之含量根據其形態不同而不同，乳酸菌之量通常為0.0001~99質量%，較佳為0.001~80質量%，更佳為0.001~75質量%之範圍。又，本發明之組合物中所含之乳酸菌為約107個/g~約1012個/g。
    藉由使用本發明之乳酸菌或組合物使獸乳醱酵，可獲得高濃度地含有胺基酸及/或肽之醱酵乳組合物。因此，本發明提供一種醱酵乳，其特徵在於：藉由使用至少1種屬於瑞士乳酸菌之乳酸菌使獸乳醱酵而獲得，且含有以下(a)~(d)中至少1種成分：
    (a)　25 μmol/ml以上、較佳為30 μmol/ml之游離胺基酸(較佳為其中15%以上為支鏈胺基酸)；
    (b)　8.5 mg/ml以上、較佳為10 mg/ml以上之肽；
    (c)　總量為260 μg/ml以上、較佳為280 μg/ml以上、更佳為300 μg/ml以上之XP肽及/或XPP肽；
    (d)　6.0 mg/g以上之IPP肽及VPP肽之單位酸度的VPP換算量。
    本發明之醱酵乳可藉由使用本發明之乳酸菌或組合物並依據該技術領域中公知之方法進行醱酵處理而製備。醱酵處理可藉由於獸乳中添加至少1種乳酸菌並於適當條件下培養而進行。作為獸乳，可使用牛乳、山羊乳、馬乳等源自哺乳動物之乳汁，或該等之脫脂乳、還原乳、煉乳等加工乳，可使用1種乳汁，亦可組合使用複數種乳汁或加工乳。乳之固形物成分濃度並無特別限定，例如，使用脫脂乳之情形時之非脂乳固形物成分濃度為3~15質量%左右，較佳為6~15質量%。獸乳亦可於醱酵處理前進行殺菌處理。獸乳中亦可添加促進乳酸菌醱酵之添加物(例如麩胺酸或葡萄糖等糖)。或者，亦可自獸乳單離乳蛋白成分，並以此種乳蛋白成分為基質進行醱酵。
    添加於獸乳中之乳酸菌較佳為使用經預培養之乳酸菌作為醱酵劑。又，添加之乳酸菌量並無限定，通常以乾燥乳酸菌體換算計為0.005~10質量%，較佳為0.05~5質量%。使用之乳酸菌可直接為乳酸菌培養物，亦可為將培養之乳酸菌藉由過濾或離心分離而自培養基分離者，亦可為自培養基分離後進行冷凍或冷凍乾燥而保存者。
    醱酵處理之條件與上述乳酸菌之培養條件大致相同，於20℃至50℃、較佳為25℃至42℃、更佳為28℃至37℃下並於厭氧條件下進行。再者，於下述實施例中，本發明之乳酸菌於30~34℃(約32℃)下特別多地生成支鏈胺基酸及功能性肽。因此，尤佳為於30~34℃下進行醱酵處理。溫度條件可藉由恆溫槽、覆套式加熱器、夾套等進行調整。醱酵處理可藉由靜置培養、振盪培養、槽培養等形式進行。又，醱酵時間可設為3小時~96小時，較佳為12~36小時。較佳為一面測定醱酵槽之pH值及酸度一面進行醱酵，pH值較佳為維持於4.0~8.0。
    以如上所述之方式獲得之醱酵乳只要含有所需成分，則可於醱酵乳中進行處理，又亦可於醱酵乳之處理物中進行進一步處理。將此種處理之例記載於下文中。
    可藉由使醱酵乳及/或醱酵乳處理物懸浮或稀釋於適當之溶劑中而製備成懸濁物或稀釋物。作為可使用之溶劑，例如可列舉：水、生理鹽水、磷酸緩衝生理鹽水(PBS)等。
    可藉由對醱酵乳及/或醱酵乳處理物進行滅菌處理而製備成滅菌處理物。對醱酵乳及/或醱酵乳處理物進行滅菌處理時，例如可進行過濾滅菌、放射性殺菌、過熱式殺菌、加壓式殺菌等公知之滅菌處理。
    可藉由對醱酵乳及/或醱酵乳處理物進行加熱處理而製備成加熱處理物。製備加熱處理物係歷經固定時間，例如約10分鐘~1小時(例如約10~20分鐘)，進行高溫處理(例如80~150℃)。
    又，可藉由對醱酵乳及/或醱酵乳處理物進行過濾或離心分離而製備成其上清液(乳清)。
    進而可使醱酵乳及/或醱酵乳處理物乾燥而製成粉狀物(粉末)或粒狀物。作為具體乾燥方法，並無特別限制，例如可列舉：噴霧乾燥、轉筒乾燥、真空乾燥、冷凍乾燥等，可將該等單獨地或組合使用。此時，亦可視需要而添加通常使用之賦形劑。
    上述處理可進行單一處理，或者亦可將複數種處理適當組合而進行。本發明中亦包含此種醱酵乳處理物。
    本發明之醱酵乳或處理物由於高濃度地含有各種胺基酸及/或肽，因此可用於利用其胺基酸及/或肽之性質之用途中。例如，胺基酸與風味、能量源、精神穩定作用、成長促進作用等有關，因此可將本發明之醱酵乳用作調味劑、營養佐劑、能量補充劑。又，含有纈胺酸、白胺酸及異白胺酸之支鏈胺基酸(BCAA)為必需胺基酸，可用於增強肌肉或預防身體疲勞。又，認為藉由丙胺酸(Ala)之存在而促進肝臟中之分解反應。又，亦已知Ala於味覺方面可引出美味，具有鹽醃、醋醃效果或刺激味等掩蓋效果。一般認為，離胺酸(Lys)係必需胺基酸中最容易不足之胺基酸，必需以抗體或激素、酵素等原材料之形式攝取。又，報告有Lys亦與鈣吸收、膠原蛋白形成、骨組織之生產有關。絲胺酸(Ser)作為磷脂絲胺酸或其他胺基酸等生物體內之各種重要物質之前驅物較為重要。又，已知其降低血膽固醇，藉由使腦內之神經元活化等抑制腦細胞死亡而防止腦之老化，或形成肌膚之保濕成分。因此，本發明之醱酵乳或處理物可用作調味劑、營養佐劑、能量補充劑、腦功能改善劑、自主神經調節劑、副交感神經調節劑、交感神經調節劑、肌肉分解損傷抑制劑、肌肉增強劑、疲勞緩解劑、耐力改善劑、酒精代謝劑等。進而VPP肽及IPP肽具有ACE抑制活性及鬆弛效果，LPP肽具有ACE抑制活性，YP肽具有降血壓作用及抗焦慮作用，VP、IP、AP、EP、RP、QP、TP、MP及GP肽為生物體內非分解性，具有ACE抑制活性，因此，本發明之醱酵乳或處理物可用作降血壓劑及壓力緩和劑。
    又，亦可自所獲得之醱酵乳或其處理物，使用公知之分離、純化法，將各種胺基酸及/或肽成分或者含有該等成分之餾分純化。
    本發明之醱酵乳或其處理物為含有上述(a)~(d)成分中之至少1種成分(例如胺基酸、肽)者，亦可組合含有複數種成分。又，於醱酵乳或其處理物中亦可含有醱酵處理中使用之乳酸菌。
    又，於本發明之醱酵乳中，只要不妨礙目標作用，則亦可單獨地或組合複數種而添加下述添加劑、其他公知之降血壓劑、壓力緩和劑、營養佐劑、能量補充劑、肌肉增強劑、調味劑等。
    本發明之醱酵乳之形態並無特別限制，例如，可製成醱酵處理後所獲得之醱酵乳原樣之懸濁液形態，以及藉由該技術領域中公知之方法進行處理所獲得之片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、粉劑、糖漿劑、乾糖漿劑等形態。醱酵乳較佳為製成容易經口投予或攝取之形態。再者，懸濁液等液體可為於即將投予或攝取之前懸浮於水或其他適當之介質中之形態，又，於片劑、顆粒劑之情形時，亦可以眾所周知之方法塗佈其表面。
    上述形態之醱酵乳可於藉由醱酵處理所獲得之醱酵乳中調配通常使用之賦形劑、崩解劑、黏合劑、濕潤劑、穩定劑、緩衝劑、潤滑劑、防腐劑、界面活性劑、甜味料、調味劑、芳香劑、酸味料、著色劑等添加劑，並依據常用方法而製造。例如，於醱酵乳以醫藥或增進健康目的使用之情形時，可調配藥學上所容許之載體或添加劑。作為此種藥學上所容許之載體及添加物之例，可列舉：水、藥學上所容許之有機溶劑、膠原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯聚合物、海藻酸鈉、水溶性葡聚糖、水溶性糊精、羧甲基澱粉鈉、果膠、三仙膠、阿拉伯膠、酪蛋白、明膠、瓊脂、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬酯酸、人類血清白蛋白、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、作為醫藥添加物所容許之界面活性劑等。
    進而，於本發明之醱酵乳中亦可使醫藥、飲食品、飼料之製造中所使用之各種添加劑或其他各種物質共存。作為此種物質或添加劑，可列舉：各種油脂(例如，大豆油、玉米油、紅花油、橄欖油等植物油，牛油、鯡魚油等動物油脂)、天然藥(例如蜂王漿、人蔘等)、胺基酸(例如麩醯胺、半胱胺酸、白胺酸、精胺酸等)、多元醇(例如乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油、糖醇，作為糖醇之例有山梨糖醇、赤藻糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、甘露醇等)、天然高分子(例如阿拉伯膠、瓊脂、水溶性玉米蛋白纖維、明膠、三仙膠、酪蛋白、麩質或麩質水解物、卵磷脂、澱粉、糊精等)、維生素(例如維生素C、維生素B群等)、礦物(例如鈣、鎂、鋅、鐵等)、食物纖維(例如甘露聚糖、果膠、半纖維素等)、界面活性劑(例如甘油脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯等)、純化水、賦形劑(例如葡萄糖、玉米澱粉、乳糖、糊精等)、穩定劑、pH值調節劑、抗氧化劑、甜味料、呈味成分、酸味料、著色料及香料等。
    又，本發明之醱酵乳中，作為上述有效成分以外之功能性成分或添加劑，例如可調配：牛磺酸、麩胱苷肽、肉鹼、肌酸、輔酶Q、葡糖醛酸、葡糖醛酸內酯、辣椒萃取物、生薑萃取物、可可萃取物、瓜拿納萃取物、藤黃果萃取物、茶胺酸、γ-胺基丁酸、辣椒素、辣椒素酯、各種有機酸、類黃酮類、多酚類、兒茶素類、黃嘌呤衍生物、低聚果糖等難消化性寡糖、聚乙烯吡咯烷酮等。該等添加劑之調配量係視添加劑之種類及所需攝取量而適當決定。
    本發明之醱酵乳之投予或攝取對象為脊椎動物，具體而言，為哺乳動物，例如人、靈長類(猿、黑猩猩等)、家畜動物(牛、馬、豬、羊、鳥等)、寵物用動物(狗、貓等)、實驗用動物(小白鼠、大白鼠等)、進而爬行動物及鳥類。尤其是希望攝取胺基酸及/或肽之對象，例如以高血壓患者、顯示由壓力導致之症狀之人、運動前後之人等作為對象較佳。
    本發明之醱酵乳之投予或攝取量根據對象之年齡及體重、投予/攝取路徑、投予/攝取次數、投予目的等而異，為能夠達成目標作用，可根據業者之斟酌而於較廣之範圍內進行變更。醱酵乳中所含之有效成分之含有比例並無特別限定，結合製造之容易性或較佳之一日投予量等而適當調節即可。由於本發明之醱酵乳安全性較高，故而亦可進一步增加攝取量。平均1日之攝取量可1次攝取，亦可分為數次攝取。又，其投予或攝取之頻率亦並無特別限定，可視投予/攝取路徑、對象之年齡及體重、目標效果之各種條件而適當選擇。
    本發明之醱酵乳之投予/攝取路徑並無特別限定，較佳為經口投予或經口攝取。例如，可調配於飲食品或飼料中，或者製成片劑或顆粒劑等，經口投予或攝取。
    本發明之醱酵乳亦可與其他醫藥、治療或預防法等並用。此種其他醫藥可與本發明之醱酵乳共同製成一種製劑，又，亦可為單獨之製劑而同時或隔開間隔投予。
    如上所述，本發明之醱酵乳可用作降血壓劑、腦功能改善劑、自主神經調節劑、副交感神經調節劑、交感神經調節劑、營養佐劑、能量補充劑、肌肉分解損傷抑制劑、肌肉增強劑、疲勞緩解劑、耐力改善劑、調味劑或酒精代謝劑等。
    本發明之乳酸菌及醱酵乳由於安全性較高且長期持續攝取較為容易，故亦可用於飲食品及飼料中。本發明之乳酸菌為大量生成具有各種功能之胺基酸及/或肽者，又本發明之醱酵乳為高濃度地含有此種胺基酸及/或肽者。進而，本發明之乳酸菌之相對於酸度之功能性肽之生成量較高，可抑制酸味，添加於各種飲食品中亦不妨礙飲食品本身之風味。因此，本發明之乳酸菌及醱酵乳可添加於各種飲食品中持續地攝取，期待各種效果。
    因此，本發明之飲食品含有本發明之至少1種乳酸菌及/或其處理物、以及/或者本發明之醱酵乳及/或其處理物。於本發明中，飲食品中亦包含飲料。本發明之飲食品中除藉由胺基酸及/或肽謀求促進健康之健康飲食品、功能性飲食品、特定保健用飲食品等之外，亦包含可調配本發明之乳酸菌及醱酵乳之所有飲食品。
    作為本發明之飲食品，尤佳為功能性飲食品。本發明之「功能性飲食品」係指對於生物體具有固定之功能性之飲食品，例如包括：包括特定保健用飲食品(包括條件性特保[特定保健用食品])及營養功能飲食品之保健功能飲食品、特殊用途飲食品、營養輔助飲食品、健康輔助飲食品、補充品(例如，片劑、包衣錠、糖衣錠、膠囊及液劑等各種劑形者)及美容飲食品(例如節食飲食品)等所有所謂健康飲食品。
    作為飲食品之具體例，可列舉：經管經腸營養劑等流食、壓片點心、片劑、咀嚼片、片劑、粉劑、散劑、膠囊劑、顆粒劑及飲劑等製劑形態之健康飲食品及營養輔助飲食品；綠茶、烏龍茶及紅茶等茶飲料、清涼飲料、果凍飲料、運動飲料、乳飲料、碳酸飲料、蔬菜飲料、果汁飲料、醱酵蔬菜飲料、醱酵果汁飲料、醱酵乳飲料、醱酵乳(優酪乳、固體酸乳酪)、醱酵乳飲料(殺菌)、乳酸菌飲料、濃縮型飲料、濃縮固形物、乳飲料(咖啡牛乳等)、飲料粉、可可飲料、牛乳以及純化水等飲料；黃油、果醬、香松及人造黃油等塗抹類；蛋黃醬、起酥油、乳蛋糕乳脂、調味汁類、麵包類、米飯類、面類、麵食、味噌湯、豆腐、酸乳酪、湯或醬料類、糕點(例如，餅乾或曲奇類、巧克力、糖果、蛋糕、冰淇淋、口香糖、含片)等。
    關於本發明之飲食品，除本發明之乳酸菌及/或醱酵乳以外，亦可調配該飲食品之製造中所使用之其他食品原材料、各種營養素、各種維生素、礦物、食物纖維、各種添加劑(例如呈味成分、甜味料、有機酸等酸味料、穩定劑、香料)等，並依據常用方法而製造。
    於本發明之飲食品中，乳酸菌、醱酵乳或該等之處理物之調配量可考慮飲食品之形態或追求之食味或食感而由業者適當決定。如此，藉由將本發明之飲食品以可管理所需攝取量之形態飲用或食用，而提供使用該飲食品之降血壓、壓力緩和、營養補充、能量輔助、肌肉增強、腦功能改善、自律神經調節、副交感神經調節、交感神經調節、肌肉分解損傷抑制、肌肉增強、疲勞感之減輕、耐力之改善、酒精代謝等方法。
    本發明之飲食品可藉由業者可利用之任意適當方法而製造。例如，可將本發明之乳酸菌及/或醱酵乳(處理物)製備成液體狀、凝膠狀、固體狀、粉末狀或顆粒狀後，再將其調配入飲食品中。或者亦可使本發明之乳酸菌及/或醱酵乳(處理物)直接混合或溶解於飲食品之原料中。乳酸菌及/或醱酵乳(處理物)亦可塗佈、包覆、滲透或附於飲食品上。乳酸菌及/或醱酵乳(處理物)可均勻地分散於飲食品中，亦可分佈不均。可調劑為裝有乳酸菌及/或醱酵乳(處理物)之膠囊等。可將乳酸菌及/或醱酵乳(處理物)以可食性膜或食用被膜劑等包裹。又，亦可於本發明之乳酸菌及/或醱酵乳(處理物)中添加適合之賦形劑等後成形為片劑等形狀。本發明之飲食品可進一步加工，此種加工品亦包含於本發明之範圍中。
    於本發明之飲食品之製造中，亦可使用飲食品中慣用之各種添加物。作為添加物，並無限定，可列舉：顯色劑(亞硝酸鈉等)、著色料(梔子色素、紅102等)、香料(橙子香料等)、甜味料(甜菊甙、阿斯巴甜等)、防腐劑(乙酸鈉、山梨酸等)、乳化劑(軟骨素硫酸鈉、丙二醇脂肪酸酯等)、抗氧化劑(EDTA二鈉、維生素C等)、pH值調整劑(檸檬酸等)、化學調味料(肌苷酸鈉等)、增黏劑(三仙膠等)、膨脹劑(碳酸鈣等)、消泡劑(磷酸鈣)等、黏合劑(聚磷酸鈉等)、營養強化劑(鈣強化劑、維生素A等)、賦形劑(水溶性糊精等)等。進而，亦可進一步添加亞洲蔘萃取物、刺五加萃取物、桉樹萃取物、杜仲茶萃取物等功能性原材料。
    本發明之飲食品如上所述，具有由胺基酸及/或肽引起之各種功能，再者安全性較高而無需擔心副作用。又，本發明之乳酸菌及/或醱酵乳可抑制酸度，風味較佳，添加於各種飲食品中亦不妨礙該飲食品之風味。所獲得之飲食品容易長期持續攝取，期待長時間地發揮各種功能。
    進而，本發明之乳酸菌及/或醱酵乳不僅可調配入人用飲食品中，亦可調配入家畜(牛、豬等)、賽馬、寵物(狗、貓等)之動物之飼料中。關於飼料，除對象為人以外，與飲食品大致相同，因此關於上述飲食品之記載對於飼料亦可同樣適用。 [實施例]
    以下，基於實施例進一步具體說明本發明，但本發明並不限定於該等實施例。 [實施例1]　L. helveticus CP3232株之鑑定
    將L. helveticus CM4株(台灣寄存編號CCRC 910111、日本寄存編號FERM BP-6060)進行育種，自所獲得之變異株中獲得顯示實施例2~5中所示之性質的新穎之L. helveticus CP3232株。
    將L. helveticus CP3232株於MRS瓊脂培養基中於37℃下厭氧培養24小時，研究所獲得之群落之形態觀察學性質及生理學性質等。又，確定16S rRNA之序列，並確認與其他瑞士乳酸菌(模式菌株，type strain)具有99.9%之同源性。藉此可知，所獲得之菌株確實屬於L. helveticus，並為新穎之菌株。 [實施例2]　醱酵乳之製備
    將對9.00%(w/w)還原脫脂乳粉進行95℃達溫殺菌再冷卻至15℃者用作乳培養基。於乳培養基中將含有乳酸菌之醱酵乳以5%之比例接種，並於37℃下培養24小時。進而，重複該操作，並將所獲得之醱酵乳用作醱酵劑。本培養係於乳培養基中添加醱酵劑3%，並於32℃或37℃下培養24小時。測定醱酵乳之pH值及酸度。酸度係使用平沼自動滴定裝置COMTITE-450(平沼產業)進行測定。作為乳酸菌，係使用L. helveticus CP3232株、及比較用L. helveticus CP3264株(自抗高血壓製品分離)、L. helveticus CM4株(台灣寄存編號CCRC 910111、日本寄存編號FERM BP-6060)、L. helveticus CP1092株、L. helveticus CP1100株、L. helveticus CP1081株及L. helveticus CPN4株(日本專利特開平7-123977號公報)。
    將其結果示於表1中。結果為，IPP之單位重量之ACE抑制活性為VPP之1.7倍，因此，將IPP量及VPP量藉由下式表示為VPP換算量：
    VPP換算量(μg/ml)=IPP量(μg/ml)×1.7+VPP量(μg/ml)
    又，「酸度」表示醱酵乳中所含之酸(乳酸)之濃度。如表1中所示，於藉由L. helveticus CP3232株之醱酵所獲得之醱酵乳中，IPP肽及VPP肽之量相對於所生成之乳酸(即酸度)以VPP換算量計為6.2 mg/g，顯示單位酸度之肽量較高。醱酵乳比重係設為1.02而算出。
    [實施例3]醱酵乳上清液中之游離胺基酸之測定
    取實施例2中所獲得之醱酵乳10000 g並離心分離10分鐘，將上清液以蒸餾水適當稀釋後，以0.2 μM之膜濾器進行過濾，並藉由高效液相層析儀(HPLC，島津製作所)之胺基酸自動分析計(C-R7A/LC-10A)進行測定。分析條件如下。
    管柱：Shim-pack Amino-Li(100 mmL×6.0 mmI.D.)
    氨捕集器：Shim-pack ISC-30Li(50 mmL×4.0 mmI.D.)
    管柱溫度：38~58℃
    反應溫度：65℃
    流動相：島津胺基酸分析用流動相套組Li型
    反應液：島津胺基酸分析用反應液套組OPA試劑
    流速：0.4 ml/min。
    為檢測脯胺酸，於反應液中添加次氯酸鈉。最終以分光螢光檢測器(Ex：348 nm，Em：450 nm)測定與鄰苯二甲醛發生反應之胺基酸之螢光顯色。作為標準物質，使用濃度已知之胺基酸混合標準型(H)算出含量。
    將其結果示於圖1及2中。圖1之A係表示使各乳酸菌於32℃下醱酵24小時所獲得之醱酵乳上清液中所含之各胺基酸量(nmol/ml)的結果，B係表示使各乳酸菌於37℃下醱酵24小時所獲得之醱酵乳上清液中所含之胺基酸量(nmol/ml)的結果。又，圖2之A係表示使各乳酸菌於32℃或37℃下醱酵24小時所獲得之醱酵乳上清液中所含之游離胺基酸總量(μmol/ml)，B係表示使各乳酸菌於32℃或37℃下醱酵24小時所獲得之醱酵乳上清液中所含之支鏈胺基酸量(μmol/ml)。根據該等結果可知，L. helveticus CP3232株具有較高之蛋白質分解活性，24小時之醱酵中生成25 mol/ml以上之游離胺基酸。尤其是於37℃下之醱酵中生成29.9 μmol/ml之游離胺基酸，於32℃下之醱酵中生成33.1 μmol/ml之游離胺基酸(圖2A)。又，顯示所生成之游離胺基酸中所含之支鏈胺基酸量較多，24小時之醱酵中所生成之游離胺基酸中15%以上為支鏈胺基酸。具體而言，於37℃下之醱酵中約19.4%為支鏈胺基酸，於32℃下之醱酵中約21.5%為支鏈胺基酸(圖2B)。 [實施例4]醱酵乳上清液中之肽量(OPA法)
    將實施例2中所獲得之醱酵乳上清液中之肽量依據Church等人(J. Dairy Sci. 1983. 66:1219-1227.)之方法進行測定。若簡單地進行說明，則係將100 mM四硼酸鈉溶液25 ml、20%SDS(Sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸鈉)2.5 ml、2-巰基乙醇0.1 ml混合，並於其中添加使對苯二甲醛溶解於甲醇中之4重量%之溶液1 ml，最終以蒸餾水製備成50 ml，從而將其製成OPA試劑。取實施例2中所獲得之醱酵乳10000 g並離心分離10分鐘，將培養上清液適當稀釋而製成分析試樣。將OPA試劑200 μl與分析試樣10 μl混合並攪拌十分鐘，此後於室溫下放置5分鐘，測定340 nm之吸收。使用胰化蛋白腖作為標準物質。
    將其結果示於圖3中。根據該結果，顯示L. helveticus CP3232株具有較高之蛋白質分解活性，藉由醱酵而生成大量肽。具體而言，於24小時之醱酵中生成8.5 mg/ml以上之肽，於32℃之醱酵中生成11.1 mg/ml之肽，於37℃之醱酵下生成9.6 mg/ml之肽(圖3)。 [實施例5]功能性肽之定量
    取實施例2中所獲得之醱酵乳10000 g並離心分離10分鐘，再將上清液以蒸餾水適當稀釋，此後以0.2 μM之膜濾器進行過濾，並以LC/MS進行分析。LC/MS分析係依據Inoue等人(J. Biosci. Bioeng.,2009,108,111-115.)之方法實施。即，於LCMS-2010A系統(島津製作所)中使用RP-aqueous Column(野村科學)作為分離管柱進行分析。以合成肽作為標準物質算出含量。合成肽係使用(13C5)Val-(13C5)Pro-Pro、Ile-(13C5)Pro-Pro、Glu-Pro、Gln-Pro(以上自Scrum公司購入)、Leu-Pro-Pro、Tyr-Pro、Val-Pro、Ile-Pro、Ala-Pro、Arg-Pro、Thr-Pro、Met-Pro、Gly-Pro(以上自Bachem公司購入)。
    將其結果示於圖4及5中。根據圖4之A及B中所示之結果可知，L. helveticus CP3232株具有較高之蛋白質分解活性，於24小時之醱酵中生成各種功能性肽。報告有，圖4中所列舉之功能性肽中，VPP及IPP具有ACE抑制活性及鬆弛效果，LPP具有ACE抑制活性，YP具有降血壓作用及抗焦慮作用，VP、IP、AP、EP、RP、QP、TP、MP及GP為生物體內非分解性，且具有ACE抑制活性。L. helveticus CP3232株尤其生成大量之VPP、IPP、YP、QP及TP。
    又，根據圖5之A及B中所示之結果可知，L. helveticus CP3232株具有較高之蛋白質分解活性，於24小時之醱酵中生成總量為260 μg/ml以上之功能性肽(XP+XPP)。尤其是於32℃下之醱酵中生成318 μmol/ml之功能性肽(圖5A)，於37℃下之醱酵中生成282 μmol/ml之功能性肽(圖5B)。 [實施例6]醱酵乳之製備及肽量之測定
    與實施例2同樣，作為乳酸菌，係使用L. helveticus CP3232株、及比較用L. helveticus CNCM I-3435株(專利文獻4)、L. helveticus FERM BP-5445株(專利文獻7)、及L. helveticus CM4株(台灣寄存編號CCRC 910111、日本寄存編號FERM BP-6060)，測定培養後之醱酵乳之pH值及酸度、以及所生成之IPP肽及VPP肽之量。
    將其結果示於表2中。結果與實施例2同樣將IPP量及VPP量表示成VPP換算量。又，「酸度」表示醱酵乳中所含之酸(乳酸)之濃度。如表2中所示，於藉由L. helveticus CP3232株醱酵所獲得之醱酵乳中，IPP肽及VPP肽之量相對於所生成之乳酸(即酸度)以VPP換算量計為7.0 mg/g，顯示單位酸度之肽量較高。醱酵乳比重係設為1.02而算出。
    [實施例7]醱酵乳上清液中之游離胺基酸之測定
    使用實施例6中所獲得之醱酵乳，與實施例3同樣地針對游離胺基酸進行測定。將其結果示於圖6及7中。
    圖6之A表示使各乳酸菌於32℃下醱酵24小時所獲得之醱酵乳上清液中所含之各胺基酸量(nmol/ml)的結果，B表示使各乳酸菌於37℃下醱酵24小時所獲得之醱酵乳上清液中所含之胺基酸量(nmol/ml)的結果。又，圖7之A表示使各乳酸菌於32℃或37℃下醱酵24小時所獲得之醱酵乳上清液中所含之游離胺基酸總量(μmol/ml)，B表示使各乳酸菌於32℃或37℃下醱酵24小時所獲得之醱酵乳上清液中所含之支鏈胺基酸量(μmol/ml)。根據該等結果可知，L. helveticus CP3232株具有較高之蛋白質分解活性，於24小時之醱酵中生成25 mol/ml以上之游離胺基酸。尤其是於37℃下之醱酵中生成28.1 μmol/ml之游離胺基酸，於32℃下之醱酵中生成32.4 μmol/ml之游離胺基酸(圖7A)。又，顯示所生成之游離胺基酸中所含之支鏈胺基酸量較多，於24小時之醱酵中所生成之游離胺基酸中15%以上為支鏈胺基酸。具體而言，於37℃下之醱酵中約20%為支鏈胺基酸，於32℃下之醱酵中約21%為支鏈胺基酸(圖7B)。 [實施例8]醱酵乳上清液中之肽量(OPA法)
    與實施例4同樣地測定實施例6中所獲得之醱酵乳上清液中之肽量。將其結果示於圖8中。根據該結果顯示，L. helveticus CP3232株具有較高之蛋白質分解活性，藉由醱酵生成大量肽。具體而言，於24小時之醱酵中生成8.5 mg/ml以上之肽，於32℃之醱酵中生成10.4 mg/ml之肽，於37℃之醱酵中生成9.1 mg/ml之肽(圖8)。 [實施例9]功能性肽之定量
    與實施例5同樣地以LC/MS分析實施例6中所獲得之醱酵乳，並測定功能性肽量。將其結果示於圖9及10中。根據圖9之A及B中所示之結果可知，L. helveticus CP3232株具有較高之蛋白質分解活性，於24小時之醱酵中生成各種功能性肽。L. helveticus CP3232株尤其生成大量之VPP、IPP、YP、QP及TP。
    又，根據圖10之A及B中所示之結果可知，L. helveticus CP3232株具有較高之蛋白質分解活性，於24小時之醱酵中生成總量為260 μg/ml以上之功能性肽(XP+XPP)。尤其是於32℃下之醱酵中生成280 μmol/ml之功能性肽(圖10A)，於37℃下之醱酵中生成295 μmol/ml之功能性肽(圖10B)。 [參考例1]L. helveticus CP3232株及其變異株之鑑定方法
    於實施例1中所獲得之乳酸菌L. helveticus CP3232株及其變異株藉由如實施例2~9中記載之方法進行測定，此外結合聚合酶鏈反應(PCR)法之識別，藉此可容易地與其他乳酸菌株區別。又，亦可藉由PCR法簡便地判定是否為作為L. helveticus CP3232株母株之L. helveticus CM4株的變異株。
    若對一例簡單地進行說明，則針對目標乳酸菌製備DNA試劑，並藉由使用以下引子之PCR法進行基因放大，以0.9%瓊脂糖凝膠進行電泳並分析其泳動圖案，藉此可判定是否為L. helveticus CP3232株之變異株，及是否為L. helveticus CM4株之變異株。 引子：
    agccacttcctccgattacag(序列編號1)、及gctattttagcagcgattcg(序列編號2)。
    於本實施例中，使用複數之L. helveticus菌株實施上述PCR法。將其結果示於圖11中。於圖11中各區帶如下。
    區帶1：L. helveticus CP3232株
    區帶2：L. helveticus CM4株
    區帶3：L. helveticus CP3231株
    區帶4：L. helveticus CP3264株
    區帶5：L. helveticus CP1081株
    區帶6：L. helveticus CP209株
    區帶7：L. helveticus CP210株
    區帶8：L. helveticus CP293株
    區帶9：L. helveticus CP617株
    區帶10：L. helveticus CP39株
    區帶11：L. helveticus CP790株
    區帶12：L. helveticus JCM1120株
    M：λ噬菌體DNA限制酵素HindIII分解物。
    如圖11中所示，CM4變異株L. helveticus CP3232株、CP3231株及母株CM4株(區帶1~3)中可確認特徵性DNA片段，其他L. helveticus株無法確認到該片段。作為DNA標記物，同時對λ噬菌體DNA之限制酵素HindIII分解物進行電泳，測定特徵性DNA片段之分子量，結果為約2.2 kb。
    再者，L. helveticus CP3232株與CP3231株、母株CM4株之識別亦可藉由實施例4及8中記載之使用OPA試劑之醱酵乳中的肽量分析而選擇L. helveticus CP3232株。即，若觀察以OPA試劑測定依據實施例2製備之醱酵乳中之肽量之值，則L. helveticus CP3231株及CM4株分別為7.5 mg/ml及4.5 mg/ml，與此相對，L. helveticus CP3232株顯示11.1 mg/ml之較高值而可容易地識別。 [參考例2]L. helveticus CP3232株及其變異株之鑑定方法
    以與參考例1相同之方式，試驗是否能夠藉由聚合酶鏈反應(PCR)法將實施例1中所獲得之乳酸菌L. helveticus CP3232株及其變異株與其他乳酸菌株(L. helveticus CNCM I-3435株(專利文獻4)及L. helveticus FERM BP-5445株(專利文獻7))加以區別。
    將藉由使用引子之PCR法進行基因放大並進行電泳之結果示於圖12中。於圖12中，各區帶如下：
    區帶1：L. helveticus CP3232株
    區帶2：L. helveticus CM4株
    區帶3：L. helveticus CNCM I-3435株
    區帶4：L. helveticus FERM BP-5445株
    M：λ噬菌體DNA限制酵素HindIII分解物。
    如圖12中所示，於作為CM4變異株之L. helveticus CP3232株及母株CM4株(區帶1及2)中確認特徵性DNA片段，其他L. helveticus株中未確認該片段。
    本說明書中引用之所有刊物、專利及專利申請案係將其全文作為參考而組入本說明書中。 [產業上之可利用性]
    根據本發明，提供一種具有高蛋白質分解活性，且肽生成能力及/或胺基酸生成能力優異之屬於瑞士乳酸菌之乳酸菌。本乳酸菌所生成之胺基酸及/或肽具有各種功能，例如IPP、VPP、YP等肽具有降血壓作用。又，藉由將本乳酸菌用於醱酵，可獲得高濃度地含有此種具有各種功能之多種胺基酸及/或肽，且風味良好之醱酵乳。因此，本發明可用於醫藥、飲食品、促進健康等領域中。 [寄存編號]
    台灣寄存編號BCRC 910539、日本寄存編號FERM BP-11271(Lactobacillus Helveticus(瑞士乳酸菌)CP3232株，台灣於2012年1月12日寄存、日本於平成22年(2010年)8月4日寄存)
    台灣寄存編號CCRC 910111、日本寄存編號FERM BP-6060(Lactobacillus Helveticus(瑞士乳酸菌)CM4株，台灣於1998年9月16日寄存、日本於平成9年(1997年)8月15日寄存) [序列表自由內容]
    序列編號1及2：DNA(合成寡核苷酸)
    <110>　具有高蛋白質分解活性之瑞士乳酸菌
    <120>　日商可爾必思股份有限公司
    <130>　PH-5013TW
    <140>　100140985
    <141>　2011-11-09
    <150>　2010-250754
    <151>　2010-11-09
    <160>　2
    <170>　PatentIn第3.4版
    <210>　1
    <211>　21
    <212>　DNA
    <213>　人工序列
    <220>
    <223>　合成寡核苷酸
    <400>　1

    <210>　2
    <211>　20
    <212>　DNA
    <213>　人工序列
    <220>
    <223>　合成寡核苷酸
    <400>　2

    圖1係表示使各乳酸菌於32℃(A)或37℃(B)下醱酵24小時所獲得之醱酵乳上清液中所含之各胺基酸量(nmol/ml)的圖表。
    圖2係表示使各乳酸菌於32℃或37℃下醱酵24小時所獲得之醱酵乳上清液中所含之游離胺基酸總量(μmol/ml)(A)及支鏈胺基酸量(μmol/ml)(B)的圖表。
    圖3係表示使各乳酸菌於32℃或37℃下醱酵24小時所獲得之醱酵乳上清液中之肽量(mg/ml)的圖表。
    圖4係使各乳酸菌於32℃(A)或37℃(B)下醱酵24小時所獲得之醱酵乳上清液中所含之功能性肽量(μg/ml)的圖表。
    圖5係表示使各乳酸菌於32℃(A)或37℃(B)下醱酵24小時所獲得之醱酵乳上清液中所含之XP肽及XPP肽之量(μg/ml)的圖表。
    圖6係表示使各乳酸菌於32℃(A)或37℃(B)下醱酵24小時所獲得之醱酵乳上清液中所含之各胺基酸量(nmol/ml)的圖表。
    圖7係表示使各乳酸菌於32℃或37℃下醱酵24小時所獲得之醱酵乳上清液中所含之游離胺基酸總量(μmol/ml)(A)及支鏈胺基酸量(μmol/ml)(B)的圖表。
    圖8係表示使各乳酸菌於32℃或37℃下醱酵24小時所獲得之醱酵乳上清液中之肽量(mg/ml)的圖表。
    圖9係表示使各乳酸菌於32℃(A)或37℃(B)下醱酵24小時所獲得之醱酵乳上清液中所含之功能性肽量(μg/ml)的圖表。
    圖10係表示使各乳酸菌於32℃(A)或37℃(B)下醱酵24小時所獲得之醱酵乳上清液中所含之XP肽及XPP肽之量(μg/ml)的圖表。
    圖11係表示藉由聚合酶鏈反應(PCR)法將源自各種乳酸菌株之基因組DNA放大之片段的電泳圖案。
    圖12係表示藉由聚合酶鏈反應(PCR)法將源自各種乳酸菌株之基因組DNA放大之片段的電泳圖案。
    (無元件符號說明)
    权利要求:
    Claims (26)
    [1] 一種屬於瑞士乳酸菌之乳酸菌，其特徵在於具有以下(a)~(d)中之至少1種性質：(a)　藉由使獸乳醱酵而生成25 μmol/ml以上之游離胺基酸；(b)　藉由使獸乳醱酵而生成8.5 mg/ml以上之肽；(c)　藉由使獸乳醱酵而生成總量為260 μg/ml以上之XP肽及/或XPP肽；(d)　使獸乳於30℃以上34℃以下醱酵所獲得之醱酵乳之單位酸度之IPP肽及VPP肽的量以VPP換算量計為6.0 mg/g以上。
    [2] 如請求項1之乳酸菌，其中游離胺基酸之15%以上為支鏈胺基酸。
    [3] 如請求項1或2之乳酸菌，其生成60 μg/ml以上之YP肽。
    [4] 如請求項1至3中任一項之乳酸菌，其為瑞士乳酸菌CM4株(台灣寄存編號CCRC 910111、日本寄存編號FERM BP-6060)之變異株。
    [5] 如請求項1至4中任一項之乳酸菌，其為瑞士乳酸菌CP3232株(台灣寄存編號BCRC 910539、日本寄存編號FERM BP-11271)或其變異株。
    [6] 一種乳酸菌，其係瑞士乳酸菌CP3232株(台灣寄存編號BCRC 910539、日本寄存編號FERM BP-11271)。
    [7] 一種用以自獸乳生成胺基酸及/或肽之組合物，其特徵在於至少含有1種屬於瑞士乳酸菌之乳酸菌。
    [8] 如請求項7之組合物，其中藉由使獸乳醱酵而生成25 μmol/ml以上之游離胺基酸。
    [9] 如請求項8之組合物，其中游離胺基酸之15%以上為支鏈胺基酸。
    [10] 如請求項7至9中任一項之組合物，其中藉由使獸乳醱酵而生成8.5 mg/ml以上之肽。
    [11] 如請求項7至10中任一項之組合物，其中藉由使獸乳醱酵而生成總量260 μg/ml以上之XP肽及/或XPP肽。
    [12] 如請求項7至11中任一項之組合物，其中藉由使獸乳醱酵而生成60 μg/ml以上之YP肽。
    [13] 如請求項7至12中任一項之組合物，其中使獸乳於30℃以上34℃以下醱酵所獲得之醱酵乳之單位酸度之IPP肽及VPP肽的量以VPP換算量計為6.0 mg/g以上。
    [14] 如請求項7至13中任一項之組合物，其中乳酸菌為如請求項1至6中任一項之乳酸菌。
    [15] 一種醱酵乳，其特徵在於：藉由使用至少1種屬於瑞士乳酸菌之乳酸菌使獸乳醱酵而獲得，且含有以下(a)~(d)中之至少1種成分：(a)　25 μmol/ml以上之游離胺基酸，(b)　8.5 mg/ml以上之肽，(c)　總量為260 μg/ml以上之XP肽及/或XPP肽，(d)　6.0 mg/g以上之IPP肽及VPP肽之單位酸度之VPP換算量。
    [16] 如請求項15之醱酵乳，其為含有至少1種屬於瑞士乳酸菌之乳酸菌者。
    [17] 如請求項15或16之醱酵乳，其為含有如請求項1至6中任一項之至少1種乳酸菌者。
    [18] 如請求項15至17中任一項之醱酵乳，其中游離胺基酸之15%以上為支鏈胺基酸。
    [19] 如請求項15至18中任一項之醱酵乳，其含有60 μg/ml以上之YP肽。
    [20] 如請求項15至19中任一項之醱酵乳，其中醱酵係於30℃以上34℃以下之溫度下進行。
    [21] 如請求項15至20中任一項之醱酵乳，其係用作降血壓劑、腦功能改善劑、自主神經調節劑、副交感神經調節劑、交感神經調節劑、營養佐劑、能量補充劑、肌肉分解損傷抑制劑、肌肉增強劑、疲勞緩解劑、耐力改善劑、調味劑或酒精代謝劑。
    [22] 一種飲食品，其特徵在於：含有如請求項1至6中任一項之至少1種乳酸菌及/或其處理物、以及/或者如請求項15至21中任一項之醱酵乳及/或其處理物。
    [23] 一種胺基酸及/或肽之製造方法，其特徵在於：使用如請求項1至6中任一項之至少1種乳酸菌或如請求項7至14中任一項之組合物使獸乳或乳蛋白醱酵，並自所獲得之醱酵物提取胺基酸及/或肽。
    [24] 如請求項23之方法，其中胺基酸為支鏈胺基酸。
    [25] 如請求項23或24之方法，其中肽為選自由XP肽及/或XPP肽所組成之群中之至少1種。
    [26] 如請求項23至25中任一項之方法，其中醱酵係於30℃以上34℃以下之溫度下進行。
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    法律状态:
    2020-07-01| MM4A| Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees|
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP2010250754||2010-11-09||
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